操作指南

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        外周血的淋巴细胞是一种已成熟的不具有进行有丝分裂能力的细胞,故不能直接用其制备染色体标本。但淋巴细e胞在植物凝集素(PHA)的刺激下,能转变为具有细胞分裂能力的母细胞。因此,外周血必须经过含有PHA的培养液培养后,才能制备供核型分析染色体标本。


1 试剂

(1)淋巴细胞培养液配制

RPMI1640液     80%

小牛血清            20%

PHA                  适量(根据厂家说明书的使用量)

肝素                  100单位

双抗                  100单位/毫升

                  细胞生长因子     适量

        最后将配好培养液的酸碱度调PH=7.2-7.4,在无菌的条件下进行配制分装。然后进行分装,每瓶4.5毫升,-20℃保存。

(2)10μg/ml 秋水仙素;
(3)0.075M 低渗液: 2.795g KCl + 500ml 蒸馏水
(4) 固定液 ——甲醇:冰醋酸=3:1(该试剂必需现配现用)


2 采血与细胞培养

        用无菌注射器吸取0.2%肝素液0.2毫升(或100单位肝素)湿润针筒,抽取被检者静脉血约2毫升,轻轻转动针筒,使之与肝素混匀,再将解冻至37℃的培养液的瓶盖用酒精棉球擦净消毒,直接用注射器从瓶盖上插入,每瓶接种0.2-0.4毫升的外周血,摇匀后于37℃培养箱培养,如果外周血样本不需要保留,注射器不需吸取肝素,直接抽血,立即接种到培养瓶内,摇匀后培养。这一方法减少污染机会,同时降低肝素的用量(培养液中已含肝素),肝素量过大,会引起溶血。


3 制备中期染色体

3.1 秋水仙素处理

      加秋水仙素的时间根据检查目的而定。如果检查放射损伤后染色体畸变应在培养44-54小时后加秋水仙素,这样可避免一部分畸变的染色体丢失;如果用于染色体疾病的诊断,则在培养66-70小时加秋水仙素,以积累更多的分裂中期细胞。 

     加入秋水仙素摇匀后,置37℃培养箱继续培养4-6小时,终止培养收集细胞。

3.2 低渗处理

      将培养物倒入10毫升的刻度离心管内,平衡离心、离心速度1000-1500转/分,时间8-10分钟。小心吸去上清,加入8毫升预热37℃的低渗液,用吸管将现溶物打匀,置37℃水浴15-20分钟。使白细胞膨胀,染色体分散,红细胞解体。

3.3 预固定

      低渗后,立即加入1毫升新配的固定液,轻轻打匀,1000-1500转/分,离心8-10分钟。3.3 固定

      离心后弃上清,留下管底的细胞,缓慢加入固定液约8毫升并轻轻打匀,37℃水浴30分钟;第一次固定时,先加数滴,轻轻将细胞打匀,再慢慢加至8毫升,打匀,这样染色体标本的形态较好。1000-1500转/分,离心8-10分钟。

3.4 再固定

     离心后,弃上清,加入8毫升固定液,打匀。于37℃水浴30分钟,平衡离心、离心速度1000-1500转/分,时间8-10分钟。

3.5 制片

     离心后,弃上清,根据沉淀的细胞量,加入适量的固定液打匀,将细胞悬液滴入1-2滴于预冻的干净玻片中央,随即吹气,轻轻过火,空气晾干。

注意事项

①器皿洗涤一定要干净,不能有酸碱残留。

②接种外周血不能太多或太少

③培养细胞温度37±0.5

④秋水仙素一定要避光保存,配制后使用期不能超过半年,秋水仙素的处理时间不要少于4小时,也不要超过6小时。

⑤低渗的时间、温度会影响染色体的分散和分裂相的数目。

⑥离心机最好用水平式,转速过快过慢直接影响标本片的质量。

⑦固定液一定要现用现配,固定要彻底,每次不少于30分钟,加固定液不能过快,要沿管壁慢慢加入,否则染色体容易扭转;固定作用不足,染色体出现毛刷状。

⑧玻片的清洁度、冷冻温度会影响染色体的铺展。




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