操作指南

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1. 试剂与材料的准备

二甲苯替代品

100%乙醇、85%乙醇、70%乙醇

蒸馏水

PBS

蛋白酶消化液

变性液

洗液:2×SSC+0.1%NP-40

塑料玻片盒

Rubber Cement

盖玻片

DAPI-抗荧光淬灭封片剂

 2. 实验步骤

⑴ 石蜡切片(标本厚度约5μm)在烘箱中90℃1小时;

⑵ 浸入二甲苯替代品中,每缸5min;

⑶ 依次在100%乙醇、85%乙醇、70%乙醇中浸泡2min,

⑷ 将片子浸泡在蒸馏水中,煮30min;PBS浸泡,5min/次,2次

⑸ 将蛋白酶消化液预热至37℃;

⑹ 把片子浸泡在蛋白酶K消化液中,37℃消化5~25min;(隔5min左右,取出片子,观察消化情况)

⑺ PBS浸泡,5min/次,2次

⑻ 依次在70%乙醇、85%乙醇、100%乙醇中浸泡1min,空气晾干;

⑼ 以下方法二选一:

玻片探针共变性

取10μl探针,滴加在标本上,盖上盖玻片,Rubber Cement封住盖玻片,杂交仪85℃变性8min;37-42℃杂交过夜。

玻片、探针分开变性

①将70%乙醇、85%乙醇、100%乙醇放入-20℃冰箱中,预冷;

②变性液水浴到77℃后,将片浸泡在其中,77℃4~6min;取出片子,立即将片子浸入预冷70%乙醇,1min,在依次将片子浸入85%乙醇、70%乙醇中,各1min;室温晾干(或用吹风机吹干,备用);

③探针加入到0.2ml离心管,放入PCR仪中,95℃变性3min,37℃平衡2min;取10μl探针滴加在标本上,盖上盖玻片,Rubber Cement封片,42℃杂交,过夜;

⑽ 将一缸洗液预热至42℃;揭去凝固的Rubber Cement,将片子浸泡在常温的洗液中,待盖玻片自动脱落;再将片子放入72℃洗液中,5min;
⑾ 将片子移至常温洗液,浸泡5min;
⑿ 70%乙醇、100%乙醇脱水,晾干;
⒀ 滴加10μl 的DAPI-抗荧光淬灭封片剂,盖上盖玻片,15min后观察。





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