操作指南

您现在的位置: > 技术支持 > 操作指南

 

1.实验试剂、材料与仪器

试剂:1mol/L NaOH溶液、2×SSC/0.1%NP-40(洗液)、75%、85%、100%乙醇、变性液、DAPI、

材料:盖玻片、0.2ml PCR管、湿盒、

仪器:水浴锅、PCR仪、染缸、玻片盒、恒温培养箱、冰箱


2.实验步骤

(1)精子涂片

(2)精子核去凝集

划定杂交区域(约20×20 mm),滴加1mol/L NaOH覆盖杂交区,在显微镜下观察,直到精子头部是原来的2倍,且精子头部呈圆形,边缘清晰,约1.5-2min。2×SSC浸泡2min,洗去NaOH(后续实验须在pH7.0-8.0条件下进行,必须除去残留的NaOH);

(3)老化

2×SSC浸泡10min。

(4)脱水

依次在75%、85%、100%乙醇中浸泡2min,晾干。

将75%、85%、100%乙醇放入冰箱-20℃预冷,待变性后脱水用。

(5)变性

加入约20mlDNA变性液到玻片盒,水浴加热至77±2℃,轻轻将玻片放入玻片盒中,77±2℃变性5min,取出后马上依次放入预冷的75%、85%、100%乙醇各2min,晾干。

注意:必须等玻片的杂交区域完全干燥,再滴加探针。

以下步骤,注意避光

(6)探针准备

按每张片子6μl探针计,根据片子数量n,微量移液器取6×n μl探针至0.2ml PCR管,探针94℃变性4min,37℃平衡2min。

(7)杂交

平衡后的探针滴加在标本上,盖盖玻片,放入湿盒中,37℃-42℃杂交过夜。

(8)洗涤

将玻片移至已经预热至42℃的洗液中,浸泡5min,再移至常温的洗液,浸泡5min.


(9)复染

滴加20μl DAPI,盖盖玻片,暗处静置15min,荧光显微镜观察(先用低倍镜找到视野,再用100倍油镜观察)。







上一篇:没有了!

下一篇:培养细胞中期染色体制备

粤ICP备12049680号